Una vez que tenemos nuestra muestra correctamente preparada, tras realizar todos los pasos explicados en la tarea anterior, procederemos a su separación. En este caso, en el último paso del proceso de preparación de la sacarina y el ciclamato, los analitos se disuelven totalmente en agua caliente, de forma que lo que obtendremos finalmente será una mezcla homogénea sobre la cual podremos aplicar distintos métodos con el fin de llevar a cabo la separación.
Se denomina mezcla a la unión de dos o más sustancias puras (sacarina/ciclamato + agua) en cantidades variables y que no se encuentran químicamente combinadas. Así, dicha mezcla no tiene un conjunto de propiedades únicas, sino que cada una de las sustancias constituyentes aporta sus propiedades específicas.
Una mezcla es homogénea, como en nuestro caso, cuando presenta las mismas propiedades y composición en todo el sistema, pudiendo ser separada en sus componentes por métodos físicos. Este tipo de mezclase se denominan también soluciones, y en ellas se pueden diferenciar un soluto y un solvente, siendo el primero el que se encuentra en menor proporción. En nuestro caso, el soluto será el agua, y el solvente será la sacarina/ciclamato, por lo que las sustancias que se mezclan tienen distintos estados de agregación al tratarse de una solución de sólido en líquido.
Gracias al siguiente cuadro se puede deducir fácilmente el tipo de mezcla con la que estamos trabajando:
Para separar los componentes que forman nuestra mezcla sin que cambien sus propiedades físicas y químicas aplicaremos distintos métodos de separación en el laboratorio, algunos de los cuales se pueden ver reflejados también en este cuadro en función del tipo de mezcla que estemos tratando:
En nuestro caso, los métodos de separación que emplearemos en la determinación de sacarina y ciclamato en edulcorantes serán:
SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN
Para poder realizar la separación mediante diversos procedimientos que explicaremos más adelante, lo que se debe realizar primeramente es la precipitación del analito que nos interesa determinar. Los procedimientos aplicados para la precipitación de sacarina y ciclamato serán distintos:
Sacarina:
Para la determinación de la sal sódica de la sacarina en una mezcla comercial de edulcorantes artificiales se empleará un método es muy selectivo, en el que debemos hacer precipitar dicha sal con el ión Ag+ (plata) con un método de inyección en flujo, que es una técnica microquímica que se usa para la automatización del análisis químico por vía húmeda, basada en la manipulación física y química de una zona de muestra dispersada que se forma a partir de la inyección de la muestra en una corriente continua de fluido portador con detección en línea y corriente abajo. A continuación se muestra una imagen de un equipo comercial:
El precipitado de sacarinato de plata formado se retiene en un filtro, se lava con ácido acético diluido y se disuelve en amonio. De esta forma se podrá realizar la determinación por espectroscopía de absorción atómica (AA), un método instrumental de la Química Analítica que está basado en la atomización del analito (en este caso, de la plata) en una matriz líquida para determinar su cantidad. La cantidad de plata presente en el precipitado, calculada por este método, será proporcional a la cantidad de sacarina presente en la muestra, siempre y cuando no se produzcan interferencias (por ejemplo, por la presencia de cloruros). En la imagen se muestra el instrumento empleado para realizar dicha espectroscopía:
Para poder aplicar este método, la sacarina se debe encontrar en la muestra en una concentración de aproximadamente 5-75 μg ml−1, con una desviación estándar relativa de un 2.7% en un rango de 20 muestras por hora.
Para más información se puede consultar el artículo que aparece en la siguiente página: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TF4-3YKKPCP-15&_user=10&_coverDate=06%2F09%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1339001382&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=76d9c6373b507f9215a0c804dc4fbdf9#m4.cor*
Ciclamato:
Para la determinación de la sal sódica del ciclamato en una mezcla comercial de edulcorantes artificiales se aplicará también un método muy selectivo basado en la inyección en flujo y espectroscopía de absorción atómica. El ácido sulfámico se oxidará a sulfuro, y se hará precipitar con el ión plomo (Pb II, IV) de la misma forma que anteriormente. El sulfuro de plomo formado se retiene en un filtro, se lava con etanol diluido y se disuelve en acetato de amonio para realizar la determinación espectroscópica del plomo. Como en el caso anterior, la cantidad de plomo existente en el precipitado será proporcional a la cantidad de ciclamato presente en la muestra. Normalmente los otros compuestos que puedan estar presentes en la no interfieren en la determinación del ciclamato por este método.
Para poder aplicar este método, el ciclamato se debe encontrar en la muestra en una concentración de aproximadamente 1-90 μg ml−1, con una desviación estándar de un 3.1% en un rango de 35 muestras por hora. El límite de detección será 0.25 μg ml−1.
Para ampliar información se puede consultar el artículo que aparece en la siguiente página: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6THP-3SBN1KJ-B&_user=2345338&_coverDate=04%2F30%2F1998&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort
** Dado que la sacarina y el ciclamato pueden precipitar en la disolución mediante los procedimientos que acabamos de explicar (con la ayuda de plata y plomo respectivamente), una vez que obtenemos el precipitado podremos aplicar sobre la preparación distintos procedimientos con el fin de separar el analito que nos interesa aislar, como pueden ser técnicas de sedimentación, centrifugación o decantación.
FILTRACIÓN
Es el más empleado, como se puede ver en las dos determinaciones explicadas anteriormente (en ambas el precipitado se retiene en un filtro). Para realizar la filtración, se hace pasar la mezcla a través de una placa porosa o un papel de filtro, de forma que el sólido (precipitado) se quedará en la superficie y el otro componente descenderá.
El método más empleado para la filtración es la llamada filtración al vacío, donde la mezcla se vierte en un embudo con papel de filtro. El sólido de la mezcla queda en el filtro y el líquido es atraído hacia un recipiente colocado abajo, gracias al vacío que se le aplica a éste con una bomba de vacío. El líquido filtrado se desecha, pues lo que interesa obtener es el sólido cristalizado que queda retenido en el filtro. El sólido se cristaliza gracias a que el vacío que genera la trompa enfría la disolución.
El material utilizado es : matraz kitasato, embudo Buchner, papel filtro, vaso de precipitados, matraz erlenmeyer, embudo de vidrio, varilla de vidrio, bomba de vacío, soporte universal, aro de soporte, nuez y los reactivos necesarios para que los analitos precipiten.
Para realizar la separación, primero añadimos los reactivos a la muestra en un vaso de precipitados. Luego preparamos la bomba de vacío con la manguera conectada al matraz kitasato puesto con el embudo Buchner y sobre este el papel filtro. Con ayuda de la varilla pasamos la solución del vaso de precipitado al embudo Buchner para obtener un filtrado al vacio. Al encender la bomba de vacío, esta hace una fuerza con la que se extrae el líquido, separándolo del soluto.
SEDIMENTACIÓN
Apenas se emplea ya que es un proceso bastante lento. Se trata de un proceso de separación mecánica mediante el cual las partículas suspendidas en un líquido o gas (en este caso el precipitado suspendido en el líquido) caen al fondo por efecto de la gravedad, debido a que tienen un peso específico mayor que el líquido o gas.
CENTRIFUGACIÓN
Es también un proceso de separación mecánica que utiliza la acción de la fuerza centrífuga para promover la aceleración de partículas en una mezcla de sólido-líquido de forma que estas caigan al fondo, lo cual se logra gracias a la rotación rápida del centrifugador. Aunque este método permite acelerar el proceso de sedimentación, tampoco es muy empleado en las determinaciones de sacarina y ciclamato.
DECANTACIÓN
Este procedimiento se aplica una vez que el precipitado ha caído al fondo del recipiente gracias a los procesos de sedimentación o la centrifugación. Entonces se retirará el líquido queda en la parte de arriba (sobrenadante), quedando solamente el sólido que nos interesa analizar.
EVAPORACIÓN
Se puede realizar, al igual que los procedimientos anteriores, una vez que tenemos la sacarina o el ciclamato precipitados en la disolución. Para realizar la separación por evaporación, calentamos la mezcla hasta el punto de ebullición del disolvente, que puede ser por ejemplo el agua destilada, tal y como explicamos en la tarea anterior para la preparación de la muestra (en este caso habría que calentar hasta 100ºC aproximadamente). Dejamos hervir hasta que se evapore totalmente, con lo que finalmente obtenemos separado el analito que nos interesa.
Esta técnica se puede aplicar porque en este caso no nos interesa conservar el componente evaporado. En caso contrario, deberíamos recurrir a otros procedimientos de separación, como los explicados anteriormente.
--> Si lo que nos interesa es retirar la sacarina de la disolución acuosa podemos aplicar un tratamiento ultrasónico por absorción con carbono activado: la descomposición ultrasónica de la sacarina tiene lugar a una frecuencia de 500 kHz en una atmósfera de argón, oxígeno y nitrógeno, y se lleva a cabo usando carbono comercial activado. Después de 180 min aproximadamente se conseguirá la eliminación de la sacarina.
En esta página aparece detallado dicho experimento:
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TW3-4FFNBX4-1&_user=2345338&_coverDate=01%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1341000280&_rerunOrigin=google&_acct=C000057006&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2345338&md5=9a409fde5ebb914d9c128de5aad9a11f
Otros métodos que se pueden emplear para la determinación de sacarina y ciclamato son:
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes de la muestra son arrastrados a través de una fase estacionaria (sólida o líquida) a medida que son transportadas por una fase fluida móvil. La separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces o sus potenciales redox.
1.CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
Es un procedimiento rápido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar o para determinar componentes individuales, como será nuestro caso. La separación se basa en que las sustancias a analizar se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra móvil: el eluyente (fase móvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción.
Las separaciones se realizan generalmente por procedimiento ascendente, introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el solvente, que será succionado por acción de fuerzas capilares.
Los aparatos y materiales que se emplean para realizarla son: cubeta cromatográfica (con tapa hermética), pipetas de Micro litro, recipiente de vidrio con pulverizador, probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para preparar y mezclar la fase móvil), secador, plantilla para TLC o regla, lámpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminución de la misma y placas cromatográficas.
Estas placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, láminas de aluminio o de fibra) sobre las que se dispone la fase estacionaria. Dependiendo de la separación a realizar, se empleará silicagel, óxido de aluminio, poliamida, celulosa, o mezclas específicas. Para la separación de nuestros analitos se empleará silicagel.
Estos componentes cargados se concentran en una estrecha banda en la base, con lo que resulta posible cargar grandes volúmenes y obtener una buena separación. La muestra se carga sobre ella con pipetas de Micro litro.
El desarrollo de la cromatografía será el siguiente: el eluyente (acetato de etilo en el caso de la sacarina) se pone en la cubeta cromatográfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separación hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cierra con su tapa para que se sature con los vapores del disolvente, y para que la saturación sea mejor se recubre la cubeta con papel secante. Para evitar eluciones, las manchas cargadas deberán situarse por encima del nivel de eluyente, cuyo ascenso se producirá por capilaridad.
Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (después de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posición de las manchas se determina por su color propio, por la disminución o amortiguación de la fluorescencia, o por reacción química (la placa una vez seca se rocía parcial o totalmente con un determinado reactivo, de manera que aparecerán coloraciones características o una fluorescencia particular).
La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y del denominado valor rf . Para conseguir la identificación, los colores propios o consecuencia del revelado y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas condiciones de desarrollo y tinción.
A pesar de las ventajas de este procedimiento, hemos encontrado que no es uno de los más empleados para la separación de los analitos que queremos determinar (sacarina y ciclamato), ya que a penas existen métodos de determinación por TLC en edulcorantes.
Únicamente encontramos que para la sacarina, se ha descubierto un nuevo método de determinación basado en este tipo de cromatografía combinada con la espectrofotometría. Para llevarlo a cabo se extrae dicho analito del alimento con cloroformo, y el residuo obtenido se disuelve en acetato de etilo y se aplica sobre una placa de gel de sílice. Después se realizará la separación cromatográfica y, una vez llevada a cabo, la cinta de sacarina se retira y se aplica sobre ella una solución de carbonato de sodio del 1 %. Después se realiza la centrifugación y se mide la absorbancia, (a 235 y 244 nm). Este método parece tener buena precisión (C.V. El 6 %) y exactitud (recuperación del 91.2 %).
Para más información se puede leer artículo presente en la siguiente página:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3614321
Además, encontramos que este método se emplea también para la determinación de sacarina en productos farmacéuticos (http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=18085281), en la cual para la separación se emplea una placa de silica-gel 60F254 y una fase móvil de etil acetato, tetracloruro de carbono y ácido acético.
2.CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
La HPLC es una de las técnicas más empleadas en la determinación de sacarina y ciclamato en edulcorantes, ya que es un método rápido, exacto, preciso y adecuado para la separación de estos analitos cuando hay incluso impurezas presentes. Permite separar los componentes de la mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones físicas o químicas entre los analitos de la muestra a analizar y la fase estacionaria, a medida que avanzan por la columna cromatográfica. El grado de retención de los componentes de la muestra va a depender de la naturaleza del compuesto, así como de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y es una propiedad identificativa de cada compuesto.
La eficiencia de esta técnica se debe a que emplea altas presiones para lograr que fluya la fase móvil de forma más eficaz (de ahí su nombre).
Además, esta técnica se complementa con una serie de detectores, como pueden ser el detector diferencial de índice de refracción, el detector de fluorescencia o el detector de espectrometría de masas.
Un ejemplo para el caso de la sacarina es emplear una columna Primesep N de tamaño 150 x 4.6 mm, una fase móvil de MeCN 85% con 10mM (pH=3), un flujo de 1.0mL/min y un detector UV a 250nm (http://www.opticsplanet.net/sielc-app-hplc-separation-of-saccharin-and-sorbitol.html).
En la tarea siguiente explicaremos más detalladamente en qué consiste esta técnica y como se aplica para el caso de la determinación de la sacarina y el ciclamato.
3.CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA (RPC)
Esta técnica se emplea para la separación del ciclamato de edulcorantes como pueden ser la sacarina, el aspartamo, el alitamo o la dulcina; y también la separación de sacarina de aspartamo, cafeína, benzoato de sodio o colorantes y harinas artificiales.
La cromatografía en fase reversa permite separar moléculas en base a su polaridad. El principio de esta cromatografía es semejante al de la cromatografía en capa fina, aunque aquí la fase estacionaria es de partículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos, lo que convierte a la fase estacionaria en una matriz apolar. Para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares (como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifáticos).
Las moléculas se retienen en la columna debido a las interacciones hidrofóbicas que establecen con la sílica modificada. Aunque en general son bastante débiles, y a menudo muy numerosas, por lo que para eluir las moléculas es casi siempre necesario disminuir la polaridad del disolvente. Para ello, se puede sustituir el agua de la fase móvil con un solvente orgánico cuya concentración se va aumentando gradualmente.
Uno de los problemas que presenta esta técnica es su costo (al usar placas no reutilizables de una matriz difícil de sintetizar) por lo que ha sido adaptada para su uso en columnas.
Este tipo de cromatografía se llama también cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) cuando se habla de purificación de proteínas y carbohidratos.
Para separar el ciclamato y la sacarina por esta técnica, se usará un sistema que consiste en una columna micro C-18.
Para más información se puede consultar el libro que aparece en internet en la siguiente página:
http://books.google.es/books?id=1c9dq_10r4IC&pg=PA531&lpg=PA531&dq=Food+analysis+by+HPLC+cyclamate&source=bl&ots=8FdqSbEqFx&sig=D_K-NhnebGUIpG2p7ldCrnPvAhg&hl=es&ei=m7TzS970FYvkmwOj5IilDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CCsQ6AEwAg#v=onepage&q=Food%20analysis%20by%20HPLC%20cyclamate&f=false
4.CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS
La cromatografía de pares iónicos (o de formación de parejas de iones) es un tipo de cromatografía de reparto en fase inversa que se utiliza emplea tanto en la determinación de ciclamato como en la de sacarina. La fase móvil está constituida por una disolución tampón acuosa que contiene un disolvente orgánico como metanol o acetonitrilo, y un compuesto iónico que aporta un contraión de carga opuesta a la del analito. El contraión se combina con el ión del analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es retenida por el relleno de fase inversa. La elución de los pares iónicos se consigue mediante una disolución acuosa de metanol o de otro disolvente orgánico soluble en agua
Para la separación del ciclamato de otros edulcorantes se ha investigado el uso de una fase móvil de 5 mM de tetrabutilamonio-p-tolueno sulfonato (pH=3.5), mezclado con un 12% de metanol.
Para la sacarina se emplearon distintos reactivos, como pentanosulfonato, fosfato de trietilamonio o tetrabutilamonio.
Aparece más información en el mismo libro:
http://books.google.es/books?id=1c9dq_10r4IC&pg=PA531&lpg=PA531&dq=Food+analysis+by+HPLC+cyclamate&source=bl&ots=8FdqSbEqFx&sig=D_K-NhnebGUIpG2p7ldCrnPvAhg&hl=es&ei=m7TzS970FYvkmwOj5IilDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CCsQ6AEwAg#v=onepage&q=Food%20analysis%20by%20HPLC%20cyclamate&f=false
ELECTROFORESIS CAPILAR
La técnica de electroforesis capilar puede llegar a ser una alternativa viable a la cromatografía líquida para la separación y determinación de edulcorantes. Esto se debe a su gran eficiencia en la separación, automatización y alta resolución, a que no requiere gran volumen de la muestra y es aplicable a todo tipo de sustancias.
Este método ha sido usado para la determinación de edulcotantes en comidas y bebidas que sólo incluyen un edulcorante, edulcorantes mixtos en comidas y jarabes, mezclas de edulcorantes y antioxidantes, etc.
Los diferentes tipos de electroforesis capilar han sido aplicados para alcanzar la separación de edulcorantes y otros compuestos. La separación se lleva a cabo en un tubo hueco de diámetro muy pequeño, de ahí que reciba el nombre de capilar. Dentro de este capilar se encuentran la disolución que contiene los analitos a separar (en este caso, sacarina o ciclamato) y el tampón o medio electrolítico que es el encargado de conducir la corriente.
Este tipo de electroforesis se lleva a cabo según la relación masa/carga de las distintas moléculas. Para que esto sea posible es necesario aplicar una diferencia de potencial entre los dos extremos del capilar que hará que las moléculas se muevan hacia un extremo u otro del capilar.
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora principios de automatización a través de un hardware creado especialmente con su software altamente optimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se puede utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado.
En realidad, se trata de dos técnicas complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de las electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos las hacen preferida entre las técnicas de separación.
ELECTROFORESIS CAPILAR ZONAL (CZE)
La electroforesis capilar zonal es una técnica de separación de los analitos en función de su relación carga/tamaño, como ya hemos citado anteriormente, que se basa en que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado, ya que este hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen. En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación.
Para la determinación del ciclamato en jugos azucarados se puede aplicar una electroforesis capilar zonal con detección ultravioleta indirecta a 254 nm. A esta técnica de determinación nos referiremos con más detalle en la tarea siguiente.
BIBLIOGRAFÍA
Otras páginas de interés de las que obtuvimos información para esta tarea son:
-acerca de los distintos tipos de mezclas:
http://iiquimica.blogspot.com/2006/07/mezclas-homogneas-y-heterogneas.html
http://www.unlu.edu.ar/~qui10017/Quimica%20COU%20muestra%20para%20IQ10017/Cap%A1tulo%20VIa.htm#sus
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TF4-3YKKPCP-15&_user=10&_coverDate=06%2F09%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1339001382&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=76d9c6373b507f9215a0c804dc4fbdf9#m4.cor*
-acerca del método de inyección en flujo:
http://www.foss.es/Solutions/ProductsDirect/FIAstar5000Systems/FlowInjectionAnalysis.aspx
http://www.ipen.gob.pe/site/publicaciones/presentaciones/fia.pdf
-acerca de la electroforesis capilar zonal:
http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UPC/AVAILABLE/TDX-0130102-115958//04cap1.pdf
http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml#capi
-acerca de la evaporación:
http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-mezclas.shtml#EVAPOR
-acerca de la filtración:
http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-mezclas.shtml#EVAPOR
http://www.monografias.com/trabajos61/filtracion/filtracion2.shtml
-acerca de la cromatografía líquida en capa fina:
http://www.unedcervera.com/c3900038/quimica_ingenieria/cromatografia.html
http://www.scribd.com/doc/14172689/5-Cromatografia-en-Capa-Fina
http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisis-aplicado-a-la-ingenieria-quimica/contenidos/course_files/Diapositivas_tema_12.pdf
-acerca de la cromatografía en fase reversa:
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPrpc.html
-acerca de la cromatografía de pares iónicos:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/28k.html
