Para validar una metodología analítica o controlar su calidad en lo referente a la exactitud, debemos conocer en primer lugar si existe algún material de referencia certificado (que tenga una matriz similar a la muestra a analizar) que podamos emplear, puesto que en el análisis químico no existen materiales de referencia que abarquen todos los analitos y todas las muestras. De hecho, para determinar la concentración del ciclamato y la sacarina no existe un material de referencia certificado, pero sí un método oficial de análisis, esto es, un método de referencia establecido por distintos organismos oficiales de forma que esté comprobada su calidad a la hora de compararlo con otras metodologías analíticas de las cuales queremos conocer su exactitud. Por lo tanto, para evaluar si el método escogido para la determinación de ciclamato y sacarina en edulcorantes es exacto debemos compararlo con su método oficial de referencia correspondiente.
Existen distintos métodos oficiales de análisis, entre los cuales explicaremos algunos de ellos, establecidos por la AOAC:
PARA EL CICLAMATO
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 969.28 DE CICLAMATO SÓDICO Y CÁLCICO EN FRUTAS EN CONSERVA:
A.MATERIAL: autoclave y homogenizador.
B.REACTIVOS: ciclamato y calcio anhidro.
1. homogeneizador
2. autoclave
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 969.27 DE EDULCORANTES NO NUTRITIVOS EN BEBIDAS NO ALCHÓLICAS POR CAPA FINA Y MÉTODO CROMATOGRÁFICO
A. MATERIAL: aparato de capa fina, luz ultravioleta.
B. REACTIVOS: disolución de butanol-alcohol, mezcla de ciclamato cálcico y sacarina sódica, y gel de sílice.
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 957.10 DE SALES DE CICLAMATO EN BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS
Aplicable a soluciones acuosas y bebidas claras carbónicas.
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 957.09 DE SALES DE CICLAMATO EN BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS
*Todos estos métodos se encuentran explicados en inglés en el CD del libro "Official Methods of Analysis of AOAC International / William Horwitz, editor ; George W. Latimer, assistant editor".
A continuación se muestra resumido uno de esos métodos oficiales a modo de ejemplo (traducido al español):
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 971.17 DE DE CICLOHEXILAMINA EN CICLAMATOS Y PRODUCTOS EDULCORADOS ARTIFICIALMENTE:
A. MATERIAL:
• Concentrador (250mL)
• Columna de destilación (longitud: 150mm)
• Funil Büchner (60mL)
• Separador (250mL)
• Micropipetas (10 y 100µL)
• Aparato de destilación
• Manta calefactora
• Cromatógrafos
• Espectrofotómetro de infrarrojos
• Papel de aluminio.
• Funil metálico
• Émbolo
• Micro jeringuilla
• Punzón
• Prensa
1. espectrofotómetro
2. cromatógrafo
B. REACTIVOS:
- Cloruro de metileno: se debe destilar y comprobar su pureza antes de su uso
- Disulfuro de carbono
- Acido clorhídrico (6M aproximadamente)
- Hidróxido sódico (10M aproximadamente)
- Ciclohexilamina (CHA): preparar soluciones estándar
- Dihidrógeno de disodio (Na2H2EDTA)
C. AISLAMIENTO POR DESTILACIÓN
Aplicable a los siguientes productos con edulcorante artificial: bebidas carbonatadas, jugos de frutas y frutas en conserva.
(a) Bebidas carbonatadas y jugos de frutas: transferir 300 ml de alícuota de muestra bien mezclada en 1L matraz y añadir suficiente10M de NaOH para obtener un pH=14. Conectar los aparatos de destilación con el matraz y destilar. Recoger 35 ml del destilado en un vaso de precipitados, agitar y colocar el vaso sobre la placa calefactora. Evaporar hasta obtener 3-5mL, retirar el vaso y enfriarlo con agua del grifo. Transferir al separador de 250mL junto con cuatro porciones de H20 de 35mL, y agregar suficiente NaOH para obtener un pH=14. Añadir 20 ml de CH2Cl2 y agitar 2 min. Dejar que las capas se separen y filtrar 20mL de la capa de CH2Cl2 a través de una capa de 30g de Na2SO4 granular anhidro. Repetir la extracción dos veces con 10 mL de CH2Cl2. Colocar los granos de SiC en el tubo concentrador, insertar la columna de destilación y concentrar el disolvente hasta 4mL en el baño de vapor. Retirar del baño, dejar enfriar, y drenar cualquier resto de disolvente en la columna de destilación y en el tubo concentrador. Concentrar nuevamente el disolvente hasta 1mL bajo el flujo de N2 de alta pureza y preservar para la inyección de gas en el cromatógrafo.
(b) Frutas en conserva: colocar la muestra (frutas y jarabe) en una licuadora de alta velocidad y mezclar aproximadamente durante 5 min. Transferir 300g de la porción de prueba para 1L matraz. Añadir 200 ml de H2O y suficiente NaOH 10M para obtener un pH=14. A continuación, añadir 10 gotas de antiespumante H-10 y destilar como en (a), pero echar 100 ml del destilado en un vaso de 400 ml que contiene 2 ml de HCl 6M. Evaporar la solución de ácido a 3-5 ml, extraer con CH2Cl2 y concentrar el combinado como en (a).
D. AISLAMIENTO POR EXTRACCIÓN
Aplicable a sales de ciclamato y a los preparados alimenticios con edulcorante.
- Ciclamato sódico: pesar una porción de 25g de muestra bien mezclada en un vaso de precipitados de 100 ml. Usando un funil, trasladar al separador de 250 ml. Lavar el vaso dos veces con porciones de 25 mL de agua caliente (aproximadamente 90°C) y transferir cada porción al separador. Añadir 50 ml más de agua caliente y agitar para disolver completamente el ciclamato. Enfriar con agua del grifo a 30°C. Añadir el NaOH 10M para obtener un pH 14. Extraer con CH2Cl2 y concentrar como en C (a).
- Preparados alimenticios con edulcorantes (concentrados líquidos que contienen ciclamato de sodio): pesar 25g de la mezcla a analizar en un vaso de precipitados de 100mL y trasladar al separador de 250 ml. Lavar el vaso de precipitado cuatro veces con 25 ml de H2O y transferir cada dosis al separador. Agitar para disolver completamente el ciclamato, y añadir suficiente NaOH 10M para obtener un pH=14. Extraer con CH2Cl2 y concentrar como en C (a).
- Ciclamato cálcico: pesar 25g de la muestra a analizar en un vaso de precipitados de 100mL. Usando un funil, transferir al separador de 250mL. Lavar el vaso de precipitados con tres porciones de 25mL de agua caliente (90ºC, igual que en el ciclamato sódico) y transferir cada porción al separador. Agitar para disolver completamente el ciclamato. A continuación, disolver 35g de Na2H2EDTA en 65mL de H2o y 10mL de NaOH 10M en un baño de vapor, verter dicha disolución en el separador y mezclar. Añadir suficiente NaOH 10M para obtener un pH=14, y después enfriar con agua del grifo hasta 30ºC. Extraer con CH2Cl2 y concentrar como en C (a).
- Preparados alimenticios con edulcorantes (concentrados líquidos que contienen ciclamato de calcio): emplear el mismo procedimiento que en el caso nterior, pero disolviendo en el baño de vapor 2.5g de Na2H2EDTA en 20mL de H2O.
E. CROMATOGRAFÍA DE GAS Y CONFIRMACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA (INFRARROJOS)
Este método que acabamos de resumir se puede ver completo en inglés en la siguiente página:
http://www.aoac.org/omarev1/971_17.pdf
PARA LA SACARINA
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 941.10 DE SACARINA EN ALIMENTOS
PRUEBAS CUALITATIVAS
1) Prueba organoléptica
2) Conversión en ácido salicílico
3) El test del ácido fenol-sulfúrico (apreciable en bebidas no alcohólicas, preparaciones semisólidas o productos horneados)
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 980.18 DE SACARINA EN ALIMENTOS
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 934.04 DE SACARINA EN BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 947.10 DE SACARINA EN ALIMENTOS
*Al igual que para el ciclamato, todos estos métodos en el CD del libro citado anteriormente.
A continuación se muestra resumido uno de esos métodos oficiales a modo de ejemplo (traducido al español):
MÉTODO OFICIAL DE ANÁLISIS 973.19 DE SACARINA EN ALIMENTOS
PREPARACIÓN DEL TEST
a) En zumos de frutas y jarabes. Se transfiere 100-200 gramos de la muestra a un matraz de 250 ml con un poco de H₂O y se diluye aproximadamente con 200 ml de H₂O. Añadir 5 ml de CH3COOH y mezclar. Añadir un ligero exceso de Pb al 20%, se mezcla y se diluye el volumen con H₂O. Homogeneizar de nuevo y filtrar.
b) En sustancias alcohólicas. Calentar 100-200 ml del líquido en un baño de vapor para eliminar el alcohol. En jarabes pesados, diluir el líquido con un volumen igual de agua antes de comenzar la evaporación. Después de la eliminación del alcohol, trasladar el líquido a un matraz aforado de 250 ml y proceder como en el apartado a).
c) Preparaciones sólidas o semisólidas.Transferir 50-75 gramos de muestra a un matraz de 250 ml con un poco de H₂O caliente y añadir una cantidad suficiente de agua para la ebullición. Deje reposar 2 horas, agitando de vez en cuando. Añadir 5 ml de CH3COOH, mezclar bien, agregar un ligero exceso de Pb al 20%, diluir con H₂O fría, mezclar, dejar reposar 20 minutos y filtrar.
DETERMINACIÓN
Transferir 150 ml del filtrado, añadir 15 ml de HCl y extraer con éter 80 ml, agitando 2 minutos de cada vez. Lavar los extractos combinados de éter con 5 ml de H₂O, retirar el éter por destilación y transferir los residuos con poco éter o bien, si las sustancias son difícilmente solubles, usar pequeñas cantidades de H₂O y éter. Evaporar el éter en Baño María, añadir al residuo 2-3 ml de Na₂CO3 al 10%, girar de modo que todos se pongan en contacto con la solución y evaporar en baño de vapor. Al residuo seco, añadir 4 gramos de una mezcla, a partes iguales, de NaCO3, anhidro y K2CO3. Calentar suavemente al principio durante 30 min. Cuando se enfríe, disolver en agua, añadir 5 ml de Br2-H2O, acidificar con HCl, filtrar, diluir el filtrado, llevar la solución a ebullición y añadir lentamente el exceso de solución de BaCl2 al 10%. Dejar reposar la mezcla durante varias horas, recoger el BaSO4 en el filtro, lavar la solución hasta que el Cl se seque y se enfríe y posteriormente, pesarlo. Analizar los resultados obtenidos.
Además de estos métodos oficiales de la AOAC, también existen otros establecidos por los distintos gobiernos.
Encontramos un ejemplo para el caso de la determinación de sacarina, dependiente del Gobierno de Canadá, que se puede observar en la siguiente página:
http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/chem/lpfc-102_01-eng.php
--> Por último, hay que añadir que dado que tanto en el caso de la sacarina como en el del ciclamato ya existe un método de referencia oficial, nos basaremos en este para evaluar la precisión de nuestro método analítico, de forma que no sería estrictamente necesario preparar una muestra de referencia ni realizar ejercicios de intercomparación entre laboratorios, ya que estos dos procedimientos se aplicarían en el caso de que no existiese dicho método oficial.
PRECISIÓN
Para validar una metodología analítica o controlar su calidad en lo referente a la precisión, es necesario realizar réplicas del analito en una disolución patrón (disolución de concentración conocida del analito preparada en el laboratorio) o de una muestra. Cada réplica será un análisis del mismo analito en la misma muestra y en condiciones similares.
En el caso de la sacarina y el ciclamato se deben realizar once réplicas, con lo que obtenemos así una serie de resultados experimentales.
Ejemplo para la sacarina:
Las gomas de mascar habitualmente contienen sacarina sola o en combinación con otros edulcorantes naturales o artificiales. La sacarina presente en la formulación de la goma de mascar está usualmente en forma de una sal soluble en agua, por ejemplo, la sal sódica. Sin embargo, esto presenta un inconveniente a la hora de vender el producto, ya que al mascar dicha goma se percibe una descarga inicial de dulzor pero esta disminuye rápidamente al ser una sal soluble y el chicle termina por perder completamente el sabor, lo cual no lo hace idóneo para el consumo.
Con el fin de prolongar el efecto edulcorante de la sacarina, se propuso utilizarla en una forma menos soluble. Sin embargo, el uso de esta forma (de ácido libre de la sacarina), tuvo un éxito limitado porque el material es todavía demasiado soluble en agua y, por tanto, sigue perdiendo rápidamente el dulzor.
En los últimos años se ha descubierto que la adición de sales de aluminio de la sacarina a las gomas de mascar proporciona un período de retención del sabor mucho más prolongado, al compararlas con formulaciones de gomas de mascar similares que contienen otras formas de sacarina.
En base a esto, propondremos un método para determinar la concentración de sal de aluminio de sacarina en una muestra de goma de mascar, añadida para hacer que dicha goma de mascar artificialmente edulcorada tenga una retención del sabor prolongada.
Los resultados experimentales obtenidos son:
80.0 ; 80.2; 80.4; 80.1; 80.1; 80.0; 80.3; 80.5; 80.7; 80.1; 79.9
Ejemplo para el ciclamato:
Propondremos un método para determinar la concentración de ciclamato sódico en frutas en conserva.
Los resultados experimentales obtenidos son:
400, 402, 405, 403, 400, 401, 399, 406, 397, 406, 401
* Para obtener los resultados de las once réplicas tomamos una serie de valores aproximados a los datos de las concentraciones normales o usuales nuestros analitos (sacarina y ciclamato) en la muestra.
Con los datos experimentales obtenidos calculamos la dispersión mediante la desviación estándar o varianza. El método más preciso será el que presente un menor valor para la misma. Sin embargo, con estos valores sólo se pueden comparar precisiones entre dos o más metodologías analíticas, por lo que para establecer la precisión de una en concreto utilizamos el coeficiente de variación: CV = (S/X) x 100
- Para la sacarina
Media = 80.3
Desviación típica o estándar = 0.0292
Coeficiente de variación = 0.036%
- Para el ciclamato
Media = 401.8
Desviación típica o estándar = 2.905
Coeficiente de variación = 0.72 %
En ambos casos existen errores de tipo aleatorio, ya que la desviación típica o estándar es distinta de cero. Por lo tanto, los resultados están dispersos; pero para saber si son o no precisos debemos fijarnos en el coeficiente de variación: si este es menor del 5% el método se considera preciso.
- Para la sacarina:
La metodología es precisa, ya que el coeficiente de variación es menor del 5% (0.036%)
- Para el ciclamato:
La metodología también es precisa, ya que el coeficiente de variación es menor del 5% (0.72 %).
