jueves, 3 de junio de 2010

TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN EMPLEADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE SACARINA Y CICLAMATO EN EDULCORANTES

La identificación de los analitos que tratamos en nuestro trabajo (sacarina y ciclamato) de forma aislada o en mezclas (edulcorantes), se realiza generalmente por métodos cromatográficos en capa fína de celulosa, sílice o alúmina. Para su determinación se emplean procedimientos gravimétrícos, métodos volumétricos ácido-base y de precipitación, así como el empleo de técnicas cromatográfícas de gases y líquida de alta resolución, electroforesis o métodos electroquímicos y espectrofotométricos (espectrofotometría infraroja y ultravioleta), entre otros.


Un gran número de métodos espectrofotométricos empleados en esta determinación usan reactivos comunes como azul de etileno, naranja de acridina, ácido fenol-sulfúrico, cristal de violeta o ferroína.

Una alternativa de los métodos espectrofotométricos es la formación y extracción de compuestos de asociación iónica entre sacarina y ciclamato con las formas protonadas de colorantes básicos. De esta forma se pueden determinar estas especies con gran sensibilidad debido a las elevadas absortividades molares de los colorantes básicos integrados en el par iónico. También se emplea la extracción con fase sólida.

Aunque resultan muy útiles en la determinación, muchas de estas técnicas necesitan equipos muy costosos y pueden requerir mucho tiempo para realizar el análisis, mientras que otras pueden tener limitaciones con respecto a la sensibilidad u otros factores.


Antes de explicar los distintos métodos de determinación que acabamos de citar para nuestros analitos, aclararemos una serie de conceptos que se reflejarán después para cada caso en los ejemplos concretos:

El límite de detección (LDD) se define habitualmente como la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con confianza por un método analítico determinado, pero no necesariamente cuantificada. Intuitivamente, sería la concentración mínima obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito)que seríamos capaces de discriminar de la concentración obtenida a partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito.

El límite de cuantificación es la mínima cantidad o concentración de analito que se puede cuantificar con precisión y exactitud, de manera reproducible de acuerdo a una validación intra o interlaboratorio.

Tanto el límite de detección como el límite de cuantificación son criterio para evaluar la sensibilidad: capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias de concentración del analito. Se evalúa mediante la sensibilidad de calibración, que es la pendiente de la curva de calibración a la concentración de interés.
La unidad de medida de la sensibilidad analítica es el inverso de la concentración de analito.

La ecuación de la recta (recta de calibrado) se obtiene mediante calibración con disoluciones de concentración perfectamente conocida (disoluciones patrón) a partir de la medida de la señal analítica proporcionada por éstas. Los pares de valores concentración-señal se ajustan a una recta, a partir de la cual pueden obtenerse la concentración del analito en muestras desconocidas.

http://www2.ine.gob.mx/bioseguridad/descargas/1ertallermonitoreo_martha_rold.pdf
http://www.quimica.urv.es/quimio/general/lod.pdf
http://personal.telefonica.terra.es/web/farmasoftware/Pagina14.html

Una vez aclarados dichos conceptos, a continuación mostraremos los procedimientos más comunes para realizar nuestra determinación y los resultados obtenidos para cada caso:


DETERMINACIÓN DE POR ESPECTROFOTOMETRÍA (SACARINA)

Este método de determinación para la sacarina es un método rápido, sencillo, sensible y libre de interferencias generadas por iones comunes o ingredientes que normalmente se encuentran en los alimentos y pueden alterar nuestros resultados; que puede emplearse para determinaciones rutinarias. Por tanto, el uso de este sistema de determinación está ampliamente extendido y, de hecho, aparece establecido como método oficial de análisis según la AOAC, en combinación con la cromatografía.

Se basa en la bromación de la sacarina para formar el derivado N-bromo, que en la reacción con ioduro de potasio libera iodina, la cual tiñe la solución de color amarillo. Para aumentar la intensidad de este color, con el fin de facilitar la determinación, se puede añadir un surfactante que es el bromuro de trimetil amonio y que luego se extrae con alcohol.

Para el análisis espectrofotométrico se empleó un espectrofotómetro “Systronic 106”, y para la medición del pH se empleó un pHmetro “Systronic 331”.
Al realizar la determinación, el máximo de absorción se observó a 400nm; y las rectas de calibrado mostraron una buena linearidad en el rango de 1.5-15μg por cada 50 mL de disolución (0.03-3 ppm).

A continuación se muestra el espectro de absorción de solución coloreada:















La absorbancia molar y la sensibilidad determinadas por este método fueron 4.76x10 10 5 l mol -1 cm -1 y 3.8 × 10 -4 µg cm -2 respectivamente.
Estas características ópticas y otras, tales como la desviación estándar relativa, el coeficiente de correlación o la recta de regresión aparecen especificadas en la siguiente tabla:











*La recta de calibrado será: Y = 0.0520X + 0.0210

La reproducibilidad del método fue comprobada realizando seis réplicas del análisis en una solución que contenía 5 µg por cada 50 ml de sacarina, y la interferencia se estudió investigando el efecto de la adición de algunas especies interferentes comunes como ácido ascórbico, ácido cítrico, gelatina, bicarbonato sódico, glucosa, sacarosa o ácido benzoico, entre otras. La mayor parte de estas especies no interfirieron en el procedimiento, por eso podemos asegurar que es un método fiable.
Para asegurar la validez del método, se añadió una cantidad determinada de sacarina a varias mezclas libres de este analito, y se observó que los porcentajes de recuperación eran de un 95.8-98.4%. Estp demostró que se trata de un método exacto y preciso.
Este método aparece explicado con más detalle en el artículo siguiente:
http://www.ijpsonline.com/article.asp?issn=0250-474X;year=2006;volume=68;issue=6;spage=821;epage=823;aulast=Mathew



DETERMINACIÓN POR HPLC (SACARINA Y CICLAMATO)

Este método es uno de los más empleados para los analitos sacarina y ciclamato. Para la determinación por este sistema, las muestras pueden inyectarse en la columna directamente o después de un pretratamiento, pero en todos los casos deben realizarse previamente los procesos de extracción, limpieza y purificación con el fin de elminar interferencias.
Esta técnica de determinación se aplicará a distintas preparaciones que contienen edulcorantes:

  • Concentrados de edulcorantes y edulcorantes en tabletas o en bebidas: en este caso, para su determinación, la muestra se diluye en agua o en fase móvil y se filtra en un filtro de membrana de un diámetro de poro de 0.45µm.
  • Bebidas carbonatadas: en este caso primero se debe eliminar el gas usando un baño ultrasónico.
  • Jugos de fruta y cócteles: requieren centrifugación y filtración para separar los sólidos o la materia insoluble.
  • Yogures, siropes, caramelos, bebidas energéticas y alimentos sólidos: para su determinación deben extraerse con agua a 40ºC, homogeneizarse y filtrarse.
  • Chocolates: en este caso se eliminan primero las grasas y después se extraen con agua caliente.

Para las determinaciones de analitos en edulcorantes, la detección se realizaba generalmente a 254 nm. Sin embargo, la tendencia hoy en día cambió hacia el uso de longitudes de onda menores, entre 200-210nm, con el fin de mejorar la detección. Además, en los analitos que presentan una baja absorción de la luz UV (como el ciclamato), se han añadido otros métodos de detección, como la conductividad, la fotometría indirecta o la detección fluorométrica con el fin de aumentar la selectividad y sensibilidad de la determinación.
Los sistemas de detección se basan en la comparación de los tiempos de retención de la muestra que contiene el analito a analizar con los tiempos de retención estándar.

Para la sacarina:

La cuantificación de la sacarina por HPLC se realizó primero por detección UV a 254nm, pero los métodos de determinación más recientes han empleado longitudes de onda menores, de entre 233-235, 227-228, 214-217 y 200-210nm. Para la detección de la sacarina se ha usado también un detector de conductividad.

Para el ciclamato:

Dado que el ciclamato presenta una baja absorción de la luz UV, los métodos de HPLC para la determinación de este analito requieren sistemas de detección específicos, como la fotometría indirecta UV o la conductivdad.

El primer caso tiene la ventaja de ser aplicable a la instrumentación de la HPLC convencional sin ningún tipo de modificación. En esta técnica, la concentración fijada de luz UV absorbida se añade a la fase móvil. La absorbancia de esta fase móvil está monitorizada y los iones soluto pueden ser fácilmente detectados por el cambio de absorbancia (tanto positivo como negativo).

En la mayoría de los métodos fotométricos indirectos, los iones absorbidos por la UV son normalmente usados cuando son compatibles con las fuentes de luz UV, tales como deuterio, mercurio y lámparas de xenón usadas en HPLC. Sin embargo, el uso de tintes cromogénicos es raramente utilizado. Es posible que el principio de fotometría indirecta en conjunto con HPLC pueda ser también aplicado a una fase móvil que contiene un ión de absorción visible. La principal ventaja de usar la detección de luz visible es que incluyen un luz brillante emitida por diodos (LEDs), fotodiodos, CCDs y fibras plásticas ópticas, que pueden ser usadas para construir una unidad de detección por HPLC relativamente barata.

Para el ciclamato, en lo referente a esta fotometría UV indirecta, se han empleado métodos de detección a 267nm usando una fase móvil de toluenosulfonato, que presenta una buena absorción de la luz UV. En el segundo caso, los detectores de conductividad se basan en que los compuestos que coeluyen con el ciclamato no presentan ninguna respuesta electroquímica y, por tanto, no aparecen en el cromatograma.

Además de estos métodos, se puede emplear también la derivatización, que se debe realizar previamente al análisis. En el caso del ciclamato, este puede determinarse con detección UV a 314nm después de su conversión en diclorociclohexilamina, la cual se separa en una columna cormatográfica de fase reversa con una fase móvil de metanol y agua. La determinación también se puede llevar a cabo a 585nm, después de la derivatización del ciclamato a metil violeta.
Por otra parte, el ciclamato se puede determinar también después de su oxidación a ciclohexilamina, la cual puede ser, o bien cuantificada por HPLC y detección UV; o bien convertida en un derivado fluorescente que se separa después en una columna cromatográfica de fase reversa usando como tampón acetonitrilo, y se cuantifica a 350-650nm de excitación y emisión, respectivamente.

Para más información se puede consultar el libro que aparece en la siguiente página: http://books.google.es/books?id=1c9dq_10r4IC&pg=PA531&lpg=PA531&dq=Food+analysis+by+HPLC+cyclamate&source=bl&ots=8FdqSbEqFx&sig=D_K-NhnebGUIpG2p7ldCrnPvAhg&hl=es&ei=m7TzS970FYvkmwOj5IilDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CCsQ6AEwAg#v=onepage&q=Food%20analysis%20by%20HPLC%20cyclamate&f=false


A continuación mostraremos algunos ejemplos concretos de determinación de sacarina y ciclamato por este método basado en la HPLC que hemos encontrado en diversos artículos:

1. DETERMINACIÓN POR HPLC COMBINADA CON ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CICLAMATO)

Este método de determinación presenta una alta sensiblidad y especificidad, y es relativamente simple. Se basa en el empleo de la cromatografía de pares iónicos y en la ionzación por espectrometría de masas. La separación se realiza una columna C8 con una solución acuosa de aminometano a pH=4.5 como fase móvil. Para más información acerca del proceso de preparación se puede consultar el artículo de la siguiente página: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TF4-4HCMSPR-1&_user=10&_coverDate=01%2F12%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1353251108&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=934b3314b35c4ce67121743f4242cd5d

Al realizar la determinación, el coeficiente de correlación de la curva de calibrado obtenida fue de 0.996, en un rango de 50-5000ng/mL. El límite de detección es de 5ng/mL y el límite de cuantificación es de 20ng/mL.


2. DETERMINACIÓN POR HPLC (CICLAMATO)

Se trata de un método rápido y simple que emplea fase reversa en HPLC combinada con fotometría indirecta visible (433nm). Para la determinación se emplea rojo de metilo, un colorante cromogénico que tiene un gran espectro de absorción UV/luz visible, con un pico máximo de absorción a los 433 nm, que fue usado para la separación cromatográfica. A continuación se muestra su espectro de absorción a diferentes ratios.














Este compuesto es un indicador de ácido-base en soluciones acuosas y está basado en la observación de los cambios de color y en el rango de pH (4.2-6.3).

De esta forma, el ciclamato es fácilmente detectado en muestras inoculadas usando una fase móvil consistente en 30 μmol dm-3 de rojo de metilo y, como disolución amortiguadora se empleó una disolución tampón fosfato (pH= 7.0) de 0.02 mol dm-3. La temperatura de la columna empleada en esta determinación es de 23º C.

El límite de detección obtenido fue 0.14 mmol dm-3 y la desviación estándar relativa del pico máximo fue del 0.58% para una solución que contenía 5.0 mmol dm-3 de ciclamato. Este método fue exitosamente aplicado y las recuperaciones de ciclamato para éstos se sitúa en un rango del 93 al 99%.

Para más información: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10885077


** En este vídeo se puede ver el desarrollo del proceso de la cromatografía líquida de alta resolución y los aparatos empleados en él (HPLC):

http://www.youtube.com/watch?v=kz_egMtdnL4




DETERMINACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR ZONAL

1. DETERMINACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR ZONAL (CICLAMATO)

Para la determinación del ciclamato en jugos azucarados se puede aplicar una electroforesis capilar zonal (CZE) con detección ultravioleta (UV) indirecta a 254 nm, tal y como explicamos en la tarea anterior.

Para realizar la determinación, el ciclamato debe separarse de los demás componentes de la muestra por capilaridad mediante una columna con sílica-gel, con un electrolito que contiene benzoato de sodio (1mM) e hidróxido de amonio (10 mM) a un voltaje de -20 KV.

Este método se puede emplear también para la determinación del ácido sórbico, que se añade en muchos casos a estos jugos como conservante, y también para la de otros edulcorantes artificiales como el aspartamo. Sin embargo, la sacarina o la cafeína, a menudo presentes también en estas bebidas (como por ejemplo, en las bebidas de cola), no pueden ser determinadas cuantitativamente por este sistema.

A continuación se muestra el electroferograma (gráfico realizado con los resultados del análisis por electroforesis) obtenido de la separación de ciclamato, acesufalmo-K, aspartamo, alitamo y sacarina; empleando un electrolito de 10mM de benzoato de sodio y 1mM de meltiamonio:













Para más información se pueden consultar la siguente página:
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TG8-4007DNC-R&_user=2345338&_coverDate=06%2F02%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1341014576&_rerunOrigin=google&_acct=C000057006&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2345338&md5=71cd546373f939bce2793e43c000160


2. DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA POR ELECTROFORESIS CAPILAR ZONAL (SACARINA Y CICLAMATO)

La electroforesis capilar zonal, además de emplearse para la determinación de ciclamato en edulcorantes, también se puede usar para determinación simultánea de aspartamo, sacarina, ciclamato y dulcina, lo cual se puede aplicar para bebidas de cola y tabletas. Las condiciones empleadas en dicha determinación se muestran en la siguiente tabla:










En este método de determinación, la electroforesis capilar se realiza con detección fotométrica indirecta, y el límite de detección para la mayor parte de los compuestos se encuentra en el rango de los nanogramos.

En este artículo aparece explicado con detalle el método de determinación que acabamos de exponer: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/59631122.pdf


3. DETERMINACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR ZONAL COMBINADA CON EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (CICLAMATO)

Otro método empleado para la determinación de ciclamato, en este caso en comidas que pueden contener edulcorantes (como pueden ser frutas en sirope o mermeladas), relacionado con los explicados anteriormente, es la electroforesis capilar zonal combinada con la extracción en fase sólida. En este caso se disuelve una muestra de 5-10 g en 0.1 mol/L de ácido clorhídrico, se homogeniza y se eleva hasta un volumen de 50mL. A continuación, la disolución obtenida pasará por diversos procesos con el fin de realizar la correcta preparación de la muestra para que esta pueda ser analizada por electroforesis capilar zonal. Estos procesos incluyen centrifugación, elución con metanol y adición a una solución de propionato sódico, y se pueden observar detallados en el artículo que se encuentra en la siguiente página: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TG8-4NCR97W-5&_user=10&_coverDate=06%2F22%2F2007&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1352899232&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=fbd50057e90ff47143a92eaffb371734

Para la electroforesis se emplea gel de sílice, y una solución amortiguadora de sorbato potásico (10 mmol/L y brumuro de trietilamonio (1mmol/L).
Para determinar el límite de detección y el máximo de absorción (longitud de onda que se empleará como referencia) se usa un detector UV. Dichos valores son 300 y 254 nm respectivamente.
Las rectas de calibrado para el ciclamato muestran una buena linearidad en el rango de 2-1000μg/mL, y los límites de detección dependen de la muestra empleada, pero se incluyen en un rango de 5-10μg/g.
El porcentaje de recuperación analizado a un nivel de 200μg/g para diversas muestras de frutas o mermeladas variba entre un 93.3% y un 108.3%, y la desviación estándar relativa era menos del 4.9%. Estos valores obtenidos en la determinación con electroforesis capilar zonal fueron muy similares a los obtenidos con HPLC.



DETERMINACION POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (SACARINA)

La cromatografía en capa fina es una técnica con muchas ventajas ya que el sistema de bandeado se puede observar directamente, además su coste es mucho menor que el de la técnica de HPLC ya que no requiere mantenimiento de bombas ni detectores y el consumo de disolventes y estacionarios es mucho más económico.
Se utilizan medios de detección por fluorescencia para la determinación de la sacarina en bebidas educoradas, así como para la determinación de cafeína y benzoato de sodio.

Los reactivos empleados son azul Nilo, perclorato, acetonitrilo, meti letil cetona, acetato de amonio, benzoato de sodio, cafeína, sacarina, perclorato, y el ácido acético glacial, y los materiales son placas HPTLC, dos lámparas UV y una microjeringa calibrada.
El tiempo total requerido para este análisis es inferior a 3 h, y el procedimiento se puede ver con detalle en el siguiente artículo: http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ed067p428?cookieSet=1. Mostraremos un breve resumen:

Procedimiento:
Pesar 50 mg del Nile Blue en un matraz. Disolver y diluir hasta la marca con acetonitrilo.
Solución de pretratamiento: pipetear 2,5 mL de la disolución anterior y pasar a un vaso de precipitados de 800-ml, luego diluir hasta 600 ml con acetonitrilo, y agitar para homogenizar. Sumergir las placas de TCL en la solución pretratamiento durante 30 min. A continuación secar aplicando calor.
Preparar las soluciones estándar y de muestra

Desarrollo de la visualización:
Coger una de las placas y aplicar en ella una gota de las disoluciones estándar a un 1cm de distancia desde el borde de la placa. En un tiempo aproximado de 6 minutos los diferentes puntos que hemos hecho migrarán hacia arriba. Después de secar la placa con una pistola de calor, se pueden visualizar bajo una lámpara UV y en un cuarto oscuro, los tres puntos a diferentes alturas. Midiendo la distancia de migración podemos calcular el Rf
Para identificar cada cada componente de la mezcla estándar depositamos 1microlitro de cada una de las soluciones de las tres mezclas en otra placa siguiendo el mismo procedimiento. Después del desarrollo, cada componente puede identificarse en base al Rf.


En la imagen se muestran los resultados de esta separación y detección por fluorescencia de la sacarina, la cafeína y el benzoato en las mezclas (a la derecha) y en una muestra de refrescos (a la izquierda).












DETERMINACIÓN POR MÉTODO GRAVIMÉTRICO (SACARINA)

Este método para la determinación de sacarina en edulcorantes, establecido por la AOAC, es un método rápido, preciso y de bajo coste.

En un principio se basaba en la bromación en un medio alcalino (reacción de Hoffman) seguida de la precipitación de BaSO4(s) en una disolución de BaCl2; pero dado que este método presentaba una baja sensibilidad y era muy costoso, pronto fue sustituido por otros más precisos y exactos, basados en el empleo de secarinato de mercurio y nitrato de mercurio, que además no requieren de una preparación previa para eliminar interferencias.

Los mejores resultados obtenidos en esta última determinación (empleando nitrato de mercurio, http://jbcs.sbq.org.br/jbcs/JBCS%201993/Vol%2004(n02)/v4n2-05.pdf ) fueron obtenidos con un pH=2, y una desviación relativa de 4.3%.



DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA POR FORMACIÓN Y EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS DE ASOCIACIÓN IÓNICA CON COLORANTES BÁSICOS (SACARINA Y CICLAMATO)

Para realizar dicha determiación se emplearon disoluciones de sacarina y ciclamato de 1g/l preparadas a partir de sal sódica, y los colorantes básicos utilizados fueron el naranja de acridina (disolución acuosa de 0.001M) y el azul Nilo (0.003M)
Para medir la absorbancia y el registro de las curvas espectrales se utilizaron espectrofotómetros con cubetas de 1 cm, y las medidas de pH se realizaron con un medidor .

La parte experimental de esta determinación se puede ver con detalle en el artículo (http://digitum.um.es/xmlui/bitstream/10201/4409/1/Determinaci%C3%B3n%20espectrofotom%C3%A9trica%20de%20sacarina%20y%20ciclamato.pdf?sequence=1), por lo que nos centraremos básicamente en los resultados obtenidos por dicho método de determinación y en las conclusiones.

La absorbancia de la sacarina se mide a 492 nm utilizando como referencia una muestra sometida al mismo tratamiento pero sin sacarina, y la recta de calibrado se prepara con diferentes volúmenes de la disolución patrón de sacarina.

La absorbancia del ciclamato se mide a 632 nm del mismo modo que la sacarina: frente a un ensayo en blanco realizado en las mismas condiciones pero carente de ciclamato.

El método se basa en el hecho de que ambos analitos se encuentran en forma aniónica en medios neutros ó débilmente ácidos y son susceptibles de asociarse a colorantes básicos para formar compuestos de asociación iónica extraíbles en disolventes orgánicos. De esta forma, la determinación espectrofotométrica en la fase orgánica resulta muy sensible debido a la alta absortividad molar del colorante. Con un adecuado estudio de las condiciones experimentales y selección del extractante se puede lograr una buena selectividad.
Se probaron distintos colorantes básicos, encontrándose buenos resultados al emplear naranja de acridina para sacarina y azul Nilo para ciclamato.Sin embargo, no fue posible conseguir simultáneamente elevados porcentajes de extracción y bajos valores para el ensayo en blanco con el empleo de diversos disolventes orgánicos puros por lo que se recurrió al empleo de mezclas de ellos, y las que mejores resultados ofrecieron fueron las formadas por metil isobutil cetona (MIBC) y ciclohexanona (CH).

Finalmente se obtuvo que los extractos orgánicos presentan máximos de absorción a 492 nm para el par iónico sacarina-anaranjado de acridina y 632 nm para el par ciclamato-azul Nilo.
Además, se ha comprobado que, tanto en el caso de ciclamato como de sacarina, son suficientes tiempos de contacto de los reaccionantes de 30 segundos y agitación de 2 minutos para conseguir valores de absorbancia máximos y constantes.


Con respecto a las gráficas de calibrado, sensibilidad y precisión en las condiciones experimentales, se obtiene una linealidad entre la absorbancia y la concentración de sacarina de 0'5-5 µgml-1 en fase acuosa, una absortividad molar aparente de 7'6 x 104 lmol-1cm-1 y un índice de sensibilidad de Sandell de 2'7x10 -3 µgcm-2.
Para el caso del ciclamato se observa comportamiento lineal entre 2-30 µgml-1 en fase acuosa con una absortividad molar de 6'6 X 10 lmol-1cm-1, y un índice de sensibilidad de Sandell de 3´04x10-2 µgcm-2.
Las desviaciones estándar relativas obtenidas para 1´0 y 3'0 µgml-1 de sacarina (10determinaciones) fueron ±2'1 y±1´6%, y para 10 y 30 µgml-1 de ciclamato ±1´9 y ±1´5%, respectivamente.


La utilidad práctica de los métodos espectrofotométricos ha sido comprobada mediante su aplicación a la determinación de sacarina en edulcorantes artificiales y gomas masticables, y de ciclamato en edulcorantes artificiales en los que se encuentra mezclado con sacarina. En el caso de la determinación de sacarina en edulcorantes artificiales, tanto líquidos como en comprimidos, es posible la determinación directa por el procedimiento propuesto, mientras que en aquellas muestras donde simultáneamente se encuentran sacarina y ciclamato es necesaria una separación previa de la sacarina por extracción en medio ácido.

lunes, 24 de mayo de 2010

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE SACARINA Y CICLAMATO EN EDULCORANTES

Una vez que tenemos nuestra muestra correctamente preparada, tras realizar todos los pasos explicados en la tarea anterior, procederemos a su separación. En este caso, en el último paso del proceso de preparación de la sacarina y el ciclamato, los analitos se disuelven totalmente en agua caliente, de forma que lo que obtendremos finalmente será una mezcla homogénea sobre la cual podremos aplicar distintos métodos con el fin de llevar a cabo la separación.
Se denomina mezcla a la unión de dos o más sustancias puras (sacarina/ciclamato + agua) en cantidades variables y que no se encuentran químicamente combinadas. Así, dicha mezcla no tiene un conjunto de propiedades únicas, sino que cada una de las sustancias constituyentes aporta sus propiedades específicas.
Una mezcla es homogénea, como en nuestro caso, cuando presenta las mismas propiedades y composición en todo el sistema, pudiendo ser separada en sus componentes por métodos físicos. Este tipo de mezclase se denominan también soluciones, y en ellas se pueden diferenciar un soluto y un solvente, siendo el primero el que se encuentra en menor proporción. En nuestro caso, el soluto será el agua, y el solvente será la sacarina/ciclamato, por lo que las sustancias que se mezclan tienen distintos estados de agregación al tratarse de una solución de sólido en líquido.
Gracias al siguiente cuadro se puede deducir fácilmente el tipo de mezcla con la que estamos trabajando:

















Para separar los componentes que forman nuestra mezcla sin que cambien sus propiedades físicas y químicas aplicaremos distintos métodos de separación en el laboratorio, algunos de los cuales se pueden ver reflejados también en este cuadro en función del tipo de mezcla que estemos tratando:

















En nuestro caso, los métodos de separación que emplearemos en la determinación de sacarina y ciclamato en edulcorantes serán:


SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN

Para poder realizar la separación mediante diversos procedimientos que explicaremos más adelante, lo que se debe realizar primeramente es la precipitación del analito que nos interesa determinar. Los procedimientos aplicados para la precipitación de sacarina y ciclamato serán distintos:

Sacarina:

Para la determinación de la sal sódica de la sacarina en una mezcla comercial de edulcorantes artificiales se empleará un método es muy selectivo, en el que debemos hacer precipitar dicha sal con el ión Ag+ (plata) con un método de inyección en flujo, que es una técnica microquímica que se usa para la automatización del análisis químico por vía húmeda, basada en la manipulación física y química de una zona de muestra dispersada que se forma a partir de la inyección de la muestra en una corriente continua de fluido portador con detección en línea y corriente abajo. A continuación se muestra una imagen de un equipo comercial:














El precipitado de sacarinato de plata formado se retiene en un filtro, se lava con ácido acético diluido y se disuelve en amonio. De esta forma se podrá realizar la determinación por espectroscopía de absorción atómica (AA), un método instrumental de la Química Analítica que está basado en la atomización del analito (en este caso, de la plata) en una matriz líquida para determinar su cantidad. La cantidad de plata presente en el precipitado, calculada por este método, será proporcional a la cantidad de sacarina presente en la muestra, siempre y cuando no se produzcan interferencias (por ejemplo, por la presencia de cloruros). En la imagen se muestra el instrumento empleado para realizar dicha espectroscopía:













Para poder aplicar este método, la sacarina se debe encontrar en la muestra en una concentración de aproximadamente 5-75 μg ml−1, con una desviación estándar relativa de un 2.7% en un rango de 20 muestras por hora.
Para más información se puede consultar el artículo que aparece en la siguiente página: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TF4-3YKKPCP-15&_user=10&_coverDate=06%2F09%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1339001382&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=76d9c6373b507f9215a0c804dc4fbdf9#m4.cor*


Ciclamato:

Para la determinación de la sal sódica del ciclamato en una mezcla comercial de edulcorantes artificiales se aplicará también un método muy selectivo basado en la inyección en flujo y espectroscopía de absorción atómica. El ácido sulfámico se oxidará a sulfuro, y se hará precipitar con el ión plomo (Pb II, IV) de la misma forma que anteriormente. El sulfuro de plomo formado se retiene en un filtro, se lava con etanol diluido y se disuelve en acetato de amonio para realizar la determinación espectroscópica del plomo. Como en el caso anterior, la cantidad de plomo existente en el precipitado será proporcional a la cantidad de ciclamato presente en la muestra. Normalmente los otros compuestos que puedan estar presentes en la no interfieren en la determinación del ciclamato por este método.
Para poder aplicar este método, el ciclamato se debe encontrar en la muestra en una concentración de aproximadamente 1-90 μg ml−1, con una desviación estándar de un 3.1% en un rango de 35 muestras por hora. El límite de detección será 0.25 μg ml−1.
Para ampliar información se puede consultar el artículo que aparece en la siguiente página: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6THP-3SBN1KJ-B&_user=2345338&_coverDate=04%2F30%2F1998&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort



** Dado que la sacarina y el ciclamato pueden precipitar en la disolución mediante los procedimientos que acabamos de explicar (con la ayuda de plata y plomo respectivamente), una vez que obtenemos el precipitado podremos aplicar sobre la preparación distintos procedimientos con el fin de separar el analito que nos interesa aislar, como pueden ser técnicas de sedimentación, centrifugación o decantación.












FILTRACIÓN


Es el más empleado, como se puede ver en las dos determinaciones explicadas anteriormente (en ambas el precipitado se retiene en un filtro). Para realizar la filtración, se hace pasar la mezcla a través de una placa porosa o un papel de filtro, de forma que el sólido (precipitado) se quedará en la superficie y el otro componente descenderá.

El método más empleado para la filtración es la llamada filtración al vacío, donde la mezcla se vierte en un embudo con papel de filtro. El sólido de la mezcla queda en el filtro y el líquido es atraído hacia un recipiente colocado abajo, gracias al vacío que se le aplica a éste con una bomba de vacío. El líquido filtrado se desecha, pues lo que interesa obtener es el sólido cristalizado que queda retenido en el filtro. El sólido se cristaliza gracias a que el vacío que genera la trompa enfría la disolución.
El material utilizado es : matraz kitasato, embudo Buchner, papel filtro, vaso de precipitados, matraz erlenmeyer, embudo de vidrio, varilla de vidrio, bomba de vacío, soporte universal, aro de soporte, nuez y los reactivos necesarios para que los analitos precipiten.
Para realizar la separación, primero añadimos los reactivos a la muestra en un vaso de precipitados. Luego preparamos la bomba de vacío con la manguera conectada al matraz kitasato puesto con el embudo Buchner y sobre este el papel filtro. Con ayuda de la varilla pasamos la solución del vaso de precipitado al embudo Buchner para obtener un filtrado al vacio. Al encender la bomba de vacío, esta hace una fuerza con la que se extrae el líquido, separándolo del soluto.





SEDIMENTACIÓN


Apenas se emplea ya que es un proceso bastante lento. Se trata de un proceso de separación mecánica mediante el cual las partículas suspendidas en un líquido o gas (en este caso el precipitado suspendido en el líquido) caen al fondo por efecto de la gravedad, debido a que tienen un peso específico mayor que el líquido o gas.


CENTRIFUGACIÓN


Es también un proceso de separación mecánica que utiliza la acción de la fuerza centrífuga para promover la aceleración de partículas en una mezcla de sólido-líquido de forma que estas caigan al fondo, lo cual se logra gracias a la rotación rápida del centrifugador. Aunque este método permite acelerar el proceso de sedimentación, tampoco es muy empleado en las determinaciones de sacarina y ciclamato.



DECANTACIÓN

Este procedimiento se aplica una vez que el precipitado ha caído al fondo del recipiente gracias a los procesos de sedimentación o la centrifugación. Entonces se retirará el líquido queda en la parte de arriba (sobrenadante), quedando solamente el sólido que nos interesa analizar.


EVAPORACIÓN


Se puede realizar, al igual que los procedimientos anteriores, una vez que tenemos la sacarina o el ciclamato precipitados en la disolución. Para realizar la separación por evaporación, calentamos la mezcla hasta el punto de ebullición del disolvente, que puede ser por ejemplo el agua destilada, tal y como explicamos en la tarea anterior para la preparación de la muestra (en este caso habría que calentar hasta 100ºC aproximadamente). Dejamos hervir hasta que se evapore totalmente, con lo que finalmente obtenemos separado el analito que nos interesa.
Esta técnica se puede aplicar porque en este caso no nos interesa conservar el componente evaporado. En caso contrario, deberíamos recurrir a otros procedimientos de separación, como los explicados anteriormente.




--> Si lo que nos interesa es retirar la sacarina de la disolución acuosa podemos aplicar un tratamiento ultrasónico por absorción con carbono activado: la descomposición ultrasónica de la sacarina tiene lugar a una frecuencia de 500 kHz en una atmósfera de argón, oxígeno y nitrógeno, y se lleva a cabo usando carbono comercial activado. Después de 180 min aproximadamente se conseguirá la eliminación de la sacarina.
En esta página aparece detallado dicho experimento:

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TW3-4FFNBX4-1&_user=2345338&_coverDate=01%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1341000280&_rerunOrigin=google&_acct=C000057006&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2345338&md5=9a409fde5ebb914d9c128de5aad9a11f


Otros métodos que se pueden emplear para la determinación de sacarina y ciclamato son:

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS


La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes de la muestra son arrastrados a través de una fase estacionaria (sólida o líquida) a medida que son transportadas por una fase fluida móvil. La separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces o sus potenciales redox.


1.CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

Es un procedimiento rápido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar o para determinar componentes individuales, como será nuestro caso. La separación se basa en que las sustancias a analizar se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra móvil: el eluyente (fase móvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción.
Las separaciones se realizan generalmente por procedimiento ascendente, introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el solvente, que será succionado por acción de fuerzas capilares.



Los aparatos y materiales que se emplean para realizarla son: cubeta cromatográfica (con tapa hermética), pipetas de Micro litro, recipiente de vidrio con pulverizador, probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para preparar y mezclar la fase móvil), secador, plantilla para TLC o regla, lámpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminución de la misma y placas cromatográficas.
Estas placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, láminas de aluminio o de fibra) sobre las que se dispone la fase estacionaria. Dependiendo de la separación a realizar, se empleará silicagel, óxido de aluminio, poliamida, celulosa, o mezclas específicas. Para la separación de nuestros analitos se empleará silicagel.
Estos componentes cargados se concentran en una estrecha banda en la base, con lo que resulta posible cargar grandes volúmenes y obtener una buena separación. La muestra se carga sobre ella con pipetas de Micro litro.

El desarrollo de la cromatografía será el siguiente: el eluyente (acetato de etilo en el caso de la sacarina) se pone en la cubeta cromatográfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separación hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cierra con su tapa para que se sature con los vapores del disolvente, y para que la saturación sea mejor se recubre la cubeta con papel secante. Para evitar eluciones, las manchas cargadas deberán situarse por encima del nivel de eluyente, cuyo ascenso se producirá por capilaridad.

Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (después de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posición de las manchas se determina por su color propio, por la disminución o amortiguación de la fluorescencia, o por reacción química (la placa una vez seca se rocía parcial o totalmente con un determinado reactivo, de manera que aparecerán coloraciones características o una fluorescencia particular).
La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y del denominado valor rf . Para conseguir la identificación, los colores propios o consecuencia del revelado y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas condiciones de desarrollo y tinción.



A pesar de las ventajas de este procedimiento, hemos encontrado que no es uno de los más empleados para la separación de los analitos que queremos determinar (sacarina y ciclamato), ya que a penas existen métodos de determinación por TLC en edulcorantes.
Únicamente encontramos que para la sacarina, se ha descubierto un nuevo método de determinación basado en este tipo de cromatografía combinada con la espectrofotometría. Para llevarlo a cabo se extrae dicho analito del alimento con cloroformo, y el residuo obtenido se disuelve en acetato de etilo y se aplica sobre una placa de gel de sílice. Después se realizará la separación cromatográfica y, una vez llevada a cabo, la cinta de sacarina se retira y se aplica sobre ella una solución de carbonato de sodio del 1 %. Después se realiza la centrifugación y se mide la absorbancia, (a 235 y 244 nm). Este método parece tener buena precisión (C.V. El 6 %) y exactitud (recuperación del 91.2 %).

Para más información se puede leer artículo presente en la siguiente página:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3614321

Además, encontramos que este método se emplea también para la determinación de sacarina en productos farmacéuticos (http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=18085281), en la cual para la separación se emplea una placa de silica-gel 60F254 y una fase móvil de etil acetato, tetracloruro de carbono y ácido acético.



2.CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

La HPLC es una de las técnicas más empleadas en la determinación de sacarina y ciclamato en edulcorantes, ya que es un método rápido, exacto, preciso y adecuado para la separación de estos analitos cuando hay incluso impurezas presentes. Permite separar los componentes de la mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones físicas o químicas entre los analitos de la muestra a analizar y la fase estacionaria, a medida que avanzan por la columna cromatográfica. El grado de retención de los componentes de la muestra va a depender de la naturaleza del compuesto, así como de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y es una propiedad identificativa de cada compuesto.
La eficiencia de esta técnica se debe a que emplea altas presiones para lograr que fluya la fase móvil de forma más eficaz (de ahí su nombre).

Además, esta técnica se complementa con una serie de detectores, como pueden ser el detector diferencial de índice de refracción, el detector de fluorescencia o el detector de espectrometría de masas.

Un ejemplo para el caso de la sacarina es emplear una columna Primesep N de tamaño 150 x 4.6 mm, una fase móvil de MeCN 85% con 10mM (pH=3), un flujo de 1.0mL/min y un detector UV a 250nm (http://www.opticsplanet.net/sielc-app-hplc-separation-of-saccharin-and-sorbitol.html).

En la tarea siguiente explicaremos más detalladamente en qué consiste esta técnica y como se aplica para el caso de la determinación de la sacarina y el ciclamato.


3.CROMATOGRAFÍA EN FASE REVERSA (RPC)

Esta técnica se emplea para la separación del ciclamato de edulcorantes como pueden ser la sacarina, el aspartamo, el alitamo o la dulcina; y también la separación de sacarina de aspartamo, cafeína, benzoato de sodio o colorantes y harinas artificiales.
La cromatografía en fase reversa permite separar moléculas en base a su polaridad. El principio de esta cromatografía es semejante al de la cromatografía en capa fina, aunque aquí la fase estacionaria es de partículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos, lo que convierte a la fase estacionaria en una matriz apolar. Para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares (como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifáticos).
Las moléculas se retienen en la columna debido a las interacciones hidrofóbicas que establecen con la sílica modificada. Aunque en general son bastante débiles, y a menudo muy numerosas, por lo que para eluir las moléculas es casi siempre necesario disminuir la polaridad del disolvente. Para ello, se puede sustituir el agua de la fase móvil con un solvente orgánico cuya concentración se va aumentando gradualmente.

Uno de los problemas que presenta esta técnica es su costo (al usar placas no reutilizables de una matriz difícil de sintetizar) por lo que ha sido adaptada para su uso en columnas.
Este tipo de cromatografía se llama también cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) cuando se habla de purificación de proteínas y carbohidratos.

Para separar el ciclamato y la sacarina por esta técnica, se usará un sistema que consiste en una columna micro C-18.

Para más información se puede consultar el libro que aparece en internet en la siguiente página:
http://books.google.es/books?id=1c9dq_10r4IC&pg=PA531&lpg=PA531&dq=Food+analysis+by+HPLC+cyclamate&source=bl&ots=8FdqSbEqFx&sig=D_K-NhnebGUIpG2p7ldCrnPvAhg&hl=es&ei=m7TzS970FYvkmwOj5IilDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CCsQ6AEwAg#v=onepage&q=Food%20analysis%20by%20HPLC%20cyclamate&f=false



4.CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS

La cromatografía de pares iónicos (o de formación de parejas de iones) es un tipo de cromatografía de reparto en fase inversa que se utiliza emplea tanto en la determinación de ciclamato como en la de sacarina. La fase móvil está constituida por una disolución tampón acuosa que contiene un disolvente orgánico como metanol o acetonitrilo, y un compuesto iónico que aporta un contraión de carga opuesta a la del analito. El contraión se combina con el ión del analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es retenida por el relleno de fase inversa. La elución de los pares iónicos se consigue mediante una disolución acuosa de metanol o de otro disolvente orgánico soluble en agua

Para la separación del ciclamato de otros edulcorantes se ha investigado el uso de una fase móvil de 5 mM de tetrabutilamonio-p-tolueno sulfonato (pH=3.5), mezclado con un 12% de metanol.
Para la sacarina se emplearon distintos reactivos, como pentanosulfonato, fosfato de trietilamonio o tetrabutilamonio.

Aparece más información en el mismo libro:
http://books.google.es/books?id=1c9dq_10r4IC&pg=PA531&lpg=PA531&dq=Food+analysis+by+HPLC+cyclamate&source=bl&ots=8FdqSbEqFx&sig=D_K-NhnebGUIpG2p7ldCrnPvAhg&hl=es&ei=m7TzS970FYvkmwOj5IilDQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=3&ved=0CCsQ6AEwAg#v=onepage&q=Food%20analysis%20by%20HPLC%20cyclamate&f=false



ELECTROFORESIS CAPILAR

La técnica de electroforesis capilar puede llegar a ser una alternativa viable a la cromatografía líquida para la separación y determinación de edulcorantes. Esto se debe a su gran eficiencia en la separación, automatización y alta resolución, a que no requiere gran volumen de la muestra y es aplicable a todo tipo de sustancias.
Este método ha sido usado para la determinación de edulcotantes en comidas y bebidas que sólo incluyen un edulcorante, edulcorantes mixtos en comidas y jarabes, mezclas de edulcorantes y antioxidantes, etc.

Los diferentes tipos de electroforesis capilar han sido aplicados para alcanzar la separación de edulcorantes y otros compuestos. La separación se lleva a cabo en un tubo hueco de diámetro muy pequeño, de ahí que reciba el nombre de capilar. Dentro de este capilar se encuentran la disolución que contiene los analitos a separar (en este caso, sacarina o ciclamato) y el tampón o medio electrolítico que es el encargado de conducir la corriente.
Este tipo de electroforesis se lleva a cabo según la relación masa/carga de las distintas moléculas. Para que esto sea posible es necesario aplicar una diferencia de potencial entre los dos extremos del capilar que hará que las moléculas se muevan hacia un extremo u otro del capilar.

Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora principios de automatización a través de un hardware creado especialmente con su software altamente optimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, se puede utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado.
En realidad, se trata de dos técnicas complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de las electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos las hacen preferida entre las técnicas de separación.





ELECTROFORESIS CAPILAR ZONAL (CZE)

La electroforesis capilar zonal es una técnica de separación de los analitos en función de su relación carga/tamaño, como ya hemos citado anteriormente, que se basa en que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado, ya que este hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen. En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación.

Para la determinación del ciclamato en jugos azucarados se puede aplicar una electroforesis capilar zonal con detección ultravioleta indirecta a 254 nm. A esta técnica de determinación nos referiremos con más detalle en la tarea siguiente.





BIBLIOGRAFÍA

Otras páginas de interés de las que obtuvimos información para esta tarea son:


-acerca de los distintos tipos de mezclas:

http://iiquimica.blogspot.com/2006/07/mezclas-homogneas-y-heterogneas.html

http://www.unlu.edu.ar/~qui10017/Quimica%20COU%20muestra%20para%20IQ10017/Cap%A1tulo%20VIa.htm#sus

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TF4-3YKKPCP-15&_user=10&_coverDate=06%2F09%2F1995&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1339001382&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=76d9c6373b507f9215a0c804dc4fbdf9#m4.co
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-acerca del método de inyección en flujo:

http://www.foss.es/Solutions/ProductsDirect/FIAstar5000Systems/FlowInjectionAnalysis.aspx

http://www.ipen.gob.pe/site/publicaciones/presentaciones/fia.pdf



-acerca de la electroforesis capilar zonal:

http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UPC/AVAILABLE/TDX-0130102-115958//04cap1.pdf


http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml#capi


-acerca de la evaporación:

http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-mezclas.shtml#EVAPOR


-acerca de la filtración:

http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-mezclas.shtml#EVAPOR

http://www.monografias.com/trabajos61/filtracion/filtracion2.shtml


-acerca de la cromatografía líquida en capa fina:

http://www.unedcervera.com/c3900038/quimica_ingenieria/cromatografia.html

http://www.scribd.com/doc/14172689/5-Cromatografia-en-Capa-Fina

http://ocw.usal.es/ciencias-experimentales/analisis-aplicado-a-la-ingenieria-quimica/contenidos/course_files/Diapositivas_tema_12.pdf


-acerca de la cromatografía en fase reversa:

http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPrpc.html


-acerca de la cromatografía de pares iónicos:

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/28k.html